對抗HIV的新型武器 — 藉由三唑化胜肽使GP120去活化

抗愛滋病毒的現況與展望

HIV為人類免疫缺乏病毒(Human Immunodeficiency Virus)，會經由體液在人與人之間傳染，攻擊人類免疫系統，使其無法正常運作。而愛滋病是感染HIV的人可能會得到的疾病，也是一直以來科學家努力研究對抗的疾病。雖然將雞尾酒療法用於治療並控制愛滋病已經有了重大的進展，每年全球仍有近 200 萬人死於愛滋病，各國也紛紛探討愛滋病毒的作用機轉，但因愛滋病毒的多重交互作用非常複雜，使各項研究增添不少困難度。目前已知愛滋病毒（HIV-1）是藉由病毒表面的GP120 三聚膜醣蛋白（trimeric envelope glycoprotein）與宿主細胞的受體（Receptor）交互作用，讓病毒進入細胞中造成感染，因此研究 gp120 與宿主細胞的交互作用便成為開發愛滋病療法的首要方向，而更新的研究結果指出，已三唑化的胜肽（peptide triazoles）可抑制愛滋病毒藉由 gp120 的交互作用進入細胞。Chaiken 與所屬的研究團隊更指出，結合奈米金粒子與多化合價三唑化胜肽，將得到具有雙重功能的重組蛋白，該蛋白與病毒結合後會改變病毒結構，進而影響病毒感染細胞的能力，降低或破壞其活性，並可作為細胞感染抑制劑。

三唑化胜肽對於愛滋病的研究具有重大意義，為大幅提升胜肽合成的純度以及效率，Chaiken 團隊特別添購CEM Liberty BlueTM 全自動微波胜肽合成系統，並使用 DIC/Oxyma 作為耦合試劑（coupling reagent），不僅為 Chaiken 團隊大幅縮短胜肽的合成時間、得到較佳的產率與純度，更能夠挑戰較難合成的胜肽序列，例如其中一種名為 KR13 的三唑化胜肽（16mer），能使愛滋病毒失去活性，運用 CEM Liberty Blue^TM 全自動微波胜肽合成系統進行合成，速度比傳統手動胜肽合成快上 36 倍，純度更達到 95% 以上，是胜肽合成研究最佳的選擇。

以高效率全自動微波胜肽合成儀進行KR13合成

使用機台為CEM公司的Liberty BlueTM 全自動微波胜肽合成儀， 美國CEM 公司為世界微波化學創始者，開發用於固相胜肽合成（Solid Phase Peptide Synthesis）的革命性全自動胜肽合成儀，能將一個完整胺基酸縮合的週期（coupling cycle）縮短至 5 分鐘內，並減少了 90% 的溶劑使用量，大幅節省了時間、人力以及試劑等成本。 Liberty Blue 改寫了固相胜肽合成的歷史，以其卓越的合成效率、極高的產率及產物純度而榮膺 2014 年度 R&D 100 大獎，上市短短數年內已熱銷近千台。

胜肽合成藥劑及配方

• 樹脂：standard Fmoc Rink amide resin。
• 胺基酸：Fmoc-protected amino acid。
• 耦合試劑（coupling reagents）：DIC/OxymaPure。
• 去保護試劑（deprotection reagents）：20% piperidine/ 0.1 M HOBt in DMF。
• 末端胺基酸（N-ter）為 Boc-Ile 。

胜肽合成操作流程

1. 樹脂預膨脹約30分鐘，再將已膨脹樹脂倒入反應槽。
2. 配製足量且指定濃度的各種胺基酸與試劑於離心管或血清瓶。
3. 離心管與血清瓶擺到機台指定位置並確認鎖緊。
4. 檢查供給氮氣來源充足且無漏氣。
5. 操作軟體編輯序列及各項條件。
6. 再次檢查所有機台設定及反應物擺設無誤。
7. 按下Start，軟體即進行自我檢查並開始進行實驗。
8. 實驗結束後，將樹脂由反應槽洗出。

若欲得到1,4-三唑化胜肽異構物，使用碘化亞銅催化（ACN／water／DIEA／pyridine），將樹脂與炔類衍生物進行 Click reaction，需要在室溫下反應 12 小時。 若欲得到 1,5 -三唑化胜肽異構物，則改以 2 mol% CpRuCl(PPh₃)₂，在 1,4-dioxane 溶劑內於室溫下反應 10 小時。

將上述做完合成的胜肽，依照胜肽純化流程將產物由樹脂上切除。

胜肽純化與分析結果

Cleavage cocktail: TFA/EDT/water/thioanisole （4.75/0.1/0.1/0.05v，v為 0.5 克樹脂，於室溫下反應 2 小時）。 已切除胜肽的溶液，使用氮氣濃縮。再用預冷乙醚清洗胜肽並離心沉澱。此清洗步驟重複進行至乙醚溶劑無顏色為止。胜肽沉澱物再使用氮氣緩慢濃縮乾燥，再重新回溶並使用C18（或 C4）RP-HPLC管柱（ACN/water/0.1% TFA）純化並收集純度 ≥ 95% 的沖提液。將沖提液凍乾後得到固狀的胜肽產物，再次用 C18 RP-HPLC 確認純度，並藉由 MALDI – TOF MS 確認分子量，結果如下表，待測物分子量與目標分子量相符，表示獲得目標胜肽產物。

高效率全自動微波胜肽合成儀促進胜肽合成的發展

各項數據結果都顯示，使用 Liberty Blue^TM 全自動微波胜肽合成儀不僅可提升數十倍的胜肽合成速度，搭配特定的耦合起始試劑（DIC／Oxyma），產出之胜肽純度可達 95% 以上，大大節省實驗室資源、人力與時間成本。另外，儀器搭載的操作軟體亦能彈性調整各項實驗的條件，並記錄所有實驗歷程，是非常先進且易操控的軟體。

• Peptide Triazole Inactivators of HIV-1 Utilize a Conserved Two-Cavity Binding Site at the Junction of the Inner and Outer Domains of Env gp120 J. Med. Chem., 2015, 58 (9), 3843–3858
• Interactions of Peptide Triazole Thiols with Env gp120 Induce Irreversible Breakdown and Inactivation of HIV-1 virions Retrovirology, 2013, 10, 153