對抗HIV的新型武器 - 藉由三唑化胜肽使GP120去活化

2019-05-15

對抗HIV的新型武器 - 藉由三唑化胜肽使GP120去活化

抗愛滋病毒的現況與展望

HIV為人類免疫缺乏病毒(Human Immunodeficiency Virus),會經由體液在人與人之間傳染,攻擊人類免疫系統,使其無法正常運作。而愛滋病是感染HIV的人可能會得到的疾病,也是一直以來科學家努力研究對抗的疾病。雖然將雞尾酒療法用於治療並控制愛滋病已經有了重大的進展,每年全球仍有近 200 萬人死於愛滋病,各國也紛紛探討愛滋病毒的作用機轉,但因愛滋病毒的多重交互作用非常複雜,使各項研究增添不少困難度。目前已知愛滋病毒(HIV-1)是藉由病毒表面的GP120 三聚膜醣蛋白(trimeric envelope glycoprotein)與宿主細胞的受體(Receptor)交互作用,讓病毒進入細胞中造成感染,因此研究 gp120 與宿主細胞的交互作用便成為開發愛滋病療法的首要方向,而更新的研究結果指出,已三唑化的胜肽(peptide triazoles)可抑制愛滋病毒藉由 gp120 的交互作用進入細胞。Chaiken 與所屬的研究團隊更指出,結合奈米金粒子與多化合價三唑化胜肽,將得到具有雙重功能的重組蛋白,該蛋白與病毒結合後會改變病毒結構,進而影響病毒感染細胞的能力,降低或破壞其活性,並可作為細胞感染抑制劑。

三唑化胜肽對於愛滋病的研究具有重大意義,為大幅提升胜肽合成的純度以及效率,Chaiken 團隊特別添購CEM Liberty BlueTM 全自動微波胜肽合成系統,並使用 DIC/Oxyma 作為耦合試劑(coupling reagent),不僅為 Chaiken 團隊大幅縮短胜肽的合成時間、得到較佳的產率與純度,更能夠挑戰較難合成的胜肽序列,例如其中一種名為 KR13 的三唑化胜肽(16mer),能使愛滋病毒失去活性,運用 CEM Liberty BlueTM 全自動微波胜肽合成系統進行合成,速度比傳統手動胜肽合成快上 36 倍,純度更達到 95% 以上,是胜肽合成研究最佳的選擇。

圖1:16 mer的三唑化胜肽KR13 ,序列為RINNIXWSEAMMAQAC-CONH22,X為ferrocenyltriazole-Pro

以高效率全自動微波胜肽合成儀進行KR13合成

使用機台為CEM公司的Liberty BlueTM 全自動微波胜肽合成儀, 美國CEM 公司為世界微波化學創始者,開發用於固相胜肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)的革命性全自動胜肽合成儀,能將一個完整胺基酸縮合的週期(coupling cycle)縮短至 5 分鐘內,並減少了 90% 的溶劑使用量,大幅節省了時間、人力以及試劑等成本。 Liberty Blue 改寫了固相胜肽合成的歷史,以其卓越的合成效率、極高的產率及產物純度而榮膺 2014 年度 R&D 100 大獎,上市短短數年內已熱銷近千台。

胜肽合成藥劑及配方

  • 樹脂:standard Fmoc Rink amide resin。
  • 胺基酸:Fmoc-protected amino acid。
  • 耦合試劑(coupling reagents):DIC/OxymaPure。
  • 去保護試劑(deprotection reagents):20% piperidine/ 0.1 M HOBt in DMF。
  • 末端胺基酸(N-ter)為 Boc-Ile 。

胜肽合成操作流程

  1. 樹脂預膨脹約30分鐘,再將已膨脹樹脂倒入反應槽。
  2. 配製足量且指定濃度的各種胺基酸與試劑於離心管或血清瓶。
  3. 離心管與血清瓶擺到機台指定位置並確認鎖緊。
  4. 檢查供給氮氣來源充足且無漏氣。
  5. 操作軟體編輯序列及各項條件。
  6. 再次檢查所有機台設定及反應物擺設無誤。
  7. 按下Start,軟體即進行自我檢查並開始進行實驗。
  8. 實驗結束後,將樹脂由反應槽洗出。

若欲得到1,4-三唑化胜肽異構物,使用碘化亞銅催化(ACN/water/DIEA/pyridine),將樹脂與炔類衍生物進行 Click reaction,需要在室溫下反應 12 小時。 若欲得到 1,5 -三唑化胜肽異構物,則改以 2 mol% CpRuCl(PPh3)2,在 1,4-dioxane 溶劑內於室溫下反應 10 小時。

將上述做完合成的胜肽,依照胜肽純化流程將產物由樹脂上切除。

胜肽純化與分析結果

Cleavage cocktail: TFA/EDT/water/thioanisole (4.75/0.1/0.1/0.05v,v為 0.5 克樹脂,於室溫下反應 2 小時)。 已切除胜肽的溶液,使用氮氣濃縮。再用預冷乙醚清洗胜肽並離心沉澱。此清洗步驟重複進行至乙醚溶劑無顏色為止。胜肽沉澱物再使用氮氣緩慢濃縮乾燥,再重新回溶並使用C18(或 C4)RP-HPLC管柱(ACN/water/0.1% TFA)純化並收集純度 ≥ 95% 的沖提液。將沖提液凍乾後得到固狀的胜肽產物,再次用 C18 RP-HPLC 確認純度,並藉由 MALDI – TOF MS 確認分子量,結果如下表,待測物分子量與目標分子量相符,表示獲得目標胜肽產物。

表1. 合成三唑化胜肽之質量確認
PeptideDesignationCalculated MassFound mass(MALDITOF)
1UM151005.91005.5
2AAR01982.4982.2
3AAP021022.41022.4
4HL091019.91019.4
5HL07926.1926.0
6AAR051005.91005.4
以不同方法合成KR13所花費的時間比較
合成方法合成一個胺基酸的時間合成整段胜肽序列所需時間
Liberty BlueTM5 分鐘80 分鐘
微波手動合成8 分鐘 (coupling only)128 分鐘
自動合成70 分鐘1120 分鐘
手動合成180 分鐘 (coupling only)2880 分鐘

高效率全自動微波胜肽合成儀促進胜肽合成的發展

各項數據結果都顯示,使用 Liberty BlueTM 全自動微波胜肽合成儀不僅可提升數十倍的胜肽合成速度,搭配特定的耦合起始試劑(DIC/Oxyma),產出之胜肽純度可達 95% 以上,大大節省實驗室資源、人力與時間成本。另外,儀器搭載的操作軟體亦能彈性調整各項實驗的條件,並記錄所有實驗歷程,是非常先進且易操控的軟體。

欲了解更多的儀器資訊與實驗細節,歡迎來電洽詢 02-2728-2767或 來信與我們聯繫

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參考文獻

  • Peptide Triazole Inactivators of HIV-1 Utilize a Conserved Two-Cavity Binding Site at the Junction of the Inner and Outer Domains of Env gp120 J. Med. Chem., 2015, 58 (9), 3843–3858
  • Interactions of Peptide Triazole Thiols with Env gp120 Induce Irreversible Breakdown and Inactivation of HIV-1 virions Retrovirology, 2013, 10, 153