從微波可以加速反應完成到微波消化的實驗訣竅，我們已經陸續分享了微波的好處、何謂微波消化、實驗的常見溫度與條件、實驗的小技巧等，接下來就要開始更深入的主題了─如何開發微波消化方法─以下是開發微波消化方法的重點與常見問題：
永遠優先考量實驗安全
首先，我們需先確保實驗安全，再來討論方法開發。
微波消化實驗會用到高溫、高壓以及強酸，因此除了基本實驗室安全注意事項外，實驗人員應受過微波消化器操作訓練，並閱讀過微波消化器使用說明書，以了解消化瓶組裝、方法設定邏輯以及反應限制(可見下圖)，並在進行任何消化實驗前，參考文獻或物質安全資料表，以確保實驗安全無虞，例如濃硝酸與苯酚混和會生成苦味酸(TNP，一種炸藥)，這種樣品便不適合微波消化。
討論到實驗室安全時，我得特別提一下過氯酸。過氯酸是極為強力的氧化試劑，消化實驗中常用來消化難溶物質，例如氧化鉻，但過氯酸與有機物的反應極強，所以不建議用於有機物消化；此外，若過氯酸蒸氣在抽風櫃管道內凝結堆積，形成易爆炸的過氯酸鹽，風險也是相當高，因此只能在具有管道清洗功能的過氯酸專用抽風櫃內操作過氯酸1。由於有爆炸風險，通常不建議使用過氯酸進行微波消化實驗。
想測什麼元素？濃度限量是多少？
先決定你有興趣的元素與其濃度限量(可接受的濃度上限)，才知道你該挑選何種等級的微波消化系統與分析儀器。以美國藥典USP<232>為例，每日最高攝取量為10克的藥品，其鉛濃度限量為500ppb；若取0.5克的這種藥品做消化，再定量至50毫升，代表鉛濃度會被稀釋100倍，所以鉛濃度限量會從「500ppb」降到「5ppb」。
若分析儀器測不到5ppb的鉛，除了換更靈敏的分析儀器，你只能想辦法提高消化液的鉛濃度，也就是增加取樣量或降低定量體積，前者與微波消化瓶組的設計及可承受樣品量上限有關，後者則要注意會不會產生分析上的干擾或基質效應，再不然你就得考慮用濃縮的方式提升消化液中的待測元素濃度。
所以說，想清楚待測元素與濃度限量，不只與方法開發有關，甚至也與儀器的選購有關，買微波消化系統以及分析儀器前一定要想清楚啊！
補充：USP<233>中提到的J值是什麼？
J值是樣品定量後上機的濃度限量，用前述的例子來說，鉛的濃度限量是500ppb，取樣量為0.5克，定量體積為50毫升時，所以消化液的鉛濃度限量會變成5ppb，此時鉛的J值就是5ppb，因此J值的高低會受到待測元素種類、取樣量以及定量體積的影響，並不是定值。
如何挑選加熱條件與反應試劑？
從蔬菜水果到航太特殊合金，消化條件天差地別，該如何挑選起始測試條件？請先做樣品分類，樣品大致上可以分為四種類型：
- 有機物：
主要由碳、氫、氧等元素構成，像是蔬菜、肉品、飲料與大多數的藥物，都屬於有機物，消化試劑常以硝酸為主，但若樣品中含有一點無機物，則須視情況添加少量鹽酸甚至氫氟酸，例如冬菜可能要混一點點鹽酸才能消化掉；油品與塑膠其實也算有機物，但反應活性較高，所以先不放這邊討論，後面會提到。
至於微波條件，200°C恆溫15分鐘足以消化大多數的有機物，但也不是所有有機物都很好做，通常有苯環的有機物都不易消化，而且環越多越難消化，像是例如人工染料蘇丹澄G，會需要特別高的溫度(250°C硝酸)才能消化至澄清。
此外，有機物消化實驗的升溫時間(從室溫加熱到目標溫度的時間)建議至少20分鐘，因為有機物分解後會產出大量廢氣(CO2、H2O、NOx等)，瓶內壓力會很高，所以必須要控制好升溫速率，以免產氣過快而傷到消化瓶。
- 無機物：
鹽酸通常是無機物消化的主要試劑，但很少單獨使用，需要與硝酸甚至氫氟酸混合使用，像黃金就需要王水(硝酸:鹽酸=1:3)才能完全消化，石灰石則需要硝酸:鹽酸:氫氟=7:1:2的混酸。不同無機物往往需要不同的混酸配方，不存在可以完美消化所有無機物的酸配方。
至於微波條件，一般土壤約175°C恆溫10分鐘便可澄清，但不鏽鋼可能需要200°C恆溫20分鐘，氧化鋯甚至需要270°C以上的超高消化溫度；幸好，無機物的消化通常不會有太多廢氣，消化瓶內的壓力也不會太高，不會讓消化管同時承受極高的溫度與壓力而影響耗材壽命。
- 高活性樣品：
泛指消化反應中溫度容易暴衝的樣品，最具代表性的就是油品了。
通常純硝酸便足以完全分解油品，但油品開始分解時會快速產出大量廢氣，因此建議設定更緩和的升溫條件，例如分段升溫，以免廢氣產出過快而讓反應瓶受到太大衝擊，這會影響到反應瓶的壽命。
表1、分段升溫範例：
| Steps | Power | Ramp (mins) | Temp | Hold |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 1000 | 10 | 120 | 5 |
| 2 | 1000 | 10 | 150 | 5 |
| 3 | 1000 | 15 | 240 | 15 |
此外，油品還有個常見到的問題：ICP-MS碳增敏問題。若消化液中殘留大量的碳，會增強部分元素的訊號，例如As與Se，導致這些元素的ICP-MS分析數值大增，常見的處理方式有三種：
- 將微波消化溫度拉到230°C以上，可避免碳的殘留。
- 參考美國FDA建議，於檢量線與消化後的樣品中添加2%IPA，以抵銷碳增敏造成的影響。
- 用標準添加法來進行分析。
塑膠也屬於高活性樣品，但實際上大多數塑膠的活性並不特別強，也未必難做，一切都與額外添加的成分有關(添加劑、抗氧化劑等)，所以酸配方不只用到硝酸，還可能用到鹽酸、硫酸甚至氫氟酸，但硝酸依然是主要消化試劑；消化溫度需求也很多變，像PET(聚對苯二甲酸乙二醇酯，寶特瓶原料)需用250°C硝酸才能完全消化，或用硫酸/硝酸進行二次消化；至於反應活性，有時真的會遇到活性超高的塑膠(活性甚至超越油品)，但你不可能從外觀判斷塑膠的反應活性高低，如果真的擔心反應太劇烈而大幅縮短消化管壽命，就把塑膠當作油品，用分段升溫來消化吧。
- 一般微波消化無法處理之樣品：
硝酸、過氧化氫、鹽酸、氫氟酸、氟硼酸、硼酸、硫酸以及磷酸，這些是微波消化領域常見到的消化試劑，幾乎99%的樣品都能以上述的消化液完全分解掉，那消化不掉的樣品呢？例如含氟聚合物(像是鐵氟龍)、石墨、高溫爐渣、碳化矽、耐火磚或鋯礦等物質，不是完全無法消化，就是消化速度極慢或僅有一部分可溶，還有哪些常見的前處理方式呢？
- 高溫灰化法：
簡單來說，就是把樣品燒成灰，把這些灰用酸溶解(或微波消化)，後續再分析酸液中的微量金屬濃度，對於酸難溶的含氟聚合物(例如鐵氟龍)來說，這是一個十分有效的方式，但高溫灰化法不適用於易揮發的金屬元素，像是Hg與As；此外，待測元素濃度過低時，也不適合使用高溫灰化法，以免灰化坩堝內的金屬不純物影響到分析結果。
- 熔融製備法：
將樣品與助熔劑(通常是無機鹽類，例如四硼酸鋰)混和於坩堝中，常見的混和比例是1:5到1:10，再加熱到數百甚至1000°C以上，讓樣品結構被破壞成不同的形式，更容易被酸、鹼或水溶解，這樣的技術就稱為熔融製備法，這個技術也可用於製作XRF可分析的玻璃片，消除樣品中顆粒、礦物質、偏析等造成的影響，同時也可降低樣品元素間的交互作用，提高分析的準確度和精確度。
消化方法確效
你費了番功夫，終於把樣品消化為澄清液體，表示實驗成功了嗎？那可不一定。
以蜂蜜為例，若把蜂蜜拿去微波消化，會得到淡黃色液體，外觀跟蜂蜜水沒兩樣，若兩者都拿去ICP-MS分析，你會發現分析結果不一致，這是因為蜂蜜中的糖分會干擾分析訊號，讓你錯估濃度，所以你不能只靠肉眼來判斷消化是否完全，液體澄清只能代表樣品已經轉化成均勻的液體，溶解在水中的樣品分子一樣可能干擾分析數據。
有兩種方式可以確認消化方法可信：拿標準參考物質來測試，或是做樣品添加實驗。
- 標準參考物質：
什麼是標準參考物質？指的是SRM(Standard Reference Materials)或CRM(Certified Reference Materials)。以NIST SRM 3254為例，這是個附有分析報告的綠茶茶葉樣品，當你用自行開發的茶葉消化方法處理此樣品，並得到與分析報告中相同的元素濃度時，代表你開發的消化方法可信。
圖3：ERM-EC681K report complete ANNEX D，Cr的標準值是100±5 mg/kg
- 樣品添加實驗：
如果找不到適合的SRM/CRM，可以改作樣品添加實驗來確效消化方法。
將適量的待測金屬元素標準品添加到樣品中，再進行消化與分析，把這組分析結果與沒有添加標準品的樣品進行比對，就可以算出添加回收率，常見的可接受回收率範圍為100±20%。
圖4：添加回收率計算方式2
基質效應
若實驗回收率不佳，卻找不出問題在哪，請確認是不是基質效應造成的影響。基質指的是樣品扣除待測物後剩下的成分，基質對分析結果造成的影響就是基質效應，而最常被實驗人員忽略的基質效應就是酸濃度。下表為Cd、Hg、Pb、Rh在不同濃度的硝酸中，以ICP-MS分析後得到的訊號強度。
表2、不同濃度硝酸對Cd、Hg、Pb、Rh的ICP-MS訊號：
| Cd訊號 | Hg訊號 | Pb訊號 | Rh訊號 | |
|---|---|---|---|---|
| 2%硝酸 | 95039 | 42342 | 289018 | 359203 |
| 30%硝酸 | 121939 | 46879 | 439438 | 829584 |
| 訊號增加程度 | 128% | 111% | 152% | 231% |
從上表可看出，只是酸濃度不同，就大大影響分析訊號強度。在配置ICP-MS檢量線時，通常會以2%(或以下)的硝酸配置檢量線，但微波消化完的樣品往往含有更高濃度的硝酸，一旦你選擇Rh作為內標，因為Rh在濃酸中的訊號會大幅強化(231%)，會間接導致其他元素的回收率大幅下降，那要如何解決？最簡單的方式就是增加檢量線的酸濃度，或是降低消化液的酸濃度，總之，讓兩者的酸濃度一致就對了。若你已經這麼做了，卻還是有基質效應的問題，那你可能要考慮使用標準添加法，或是更換內標了。
結論
進行微波消化方法開發時，實驗安全永遠是要優先考量的第一重點，之後則必須考慮待測元素與濃度限量、微波消化條件與酸試劑配方、消化方法確效以及是否會有基質效應，而這一切都與選購的儀器性能環環相扣。
如果你購買了一台ICP-MS，但卻配了一台性能不佳的微波消化系統，你可能沒辦法把樣品消化至澄清、沒辦法把消化溫度拉高來避免碳增敏、也沒辦法拉高樣品量來分析低濃度的樣品、或耗材設計不佳不耐用，所以在計畫添購儀器時，你應該要完整考量微波消化系統以及後端分析儀器的性能，並尋找專業的廠商，才能讓你更輕鬆找到最好的微波消化條件，在最短時間之內完成方法開發。
如果你還是搞不懂如何進行微波消化方法開發與確效的方式，歡迎來電洽詢 02-2728-2767或 來信與我們聯繫
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參考文獻
- A Guideline for the Use of Perchloric Acid and Perchloric Acid Fume Hoods, April 2016, Office of the Chief Inspector of Mines
- 衛生福利部食品藥物管理署檢驗機構實驗室品質系統基本規範：檢驗機構化學領域檢驗結果之品質管制
