如何選擇合適的細胞存活測試法?

什麼是細胞存活率？

細胞存活率是測量一個細胞群體中活細胞所占的比例。存活率是將樣品中的活細胞總數與死細胞總數相比所得到的百分比。當存活率越高，代表樣品中所含有的活細胞數越多。

為什麼要測量細胞存活率？

許多實驗基礎都跟細胞存活率測量息息相關，像是細胞培養實驗中需要確認不同時間點細胞的數量與狀態，以確保實驗能夠順利進行。另一方面，在藥物開發的過程中，細胞存活率也時常被用來評估藥物對不同細胞造成的影響，時常當作避免轉移及新治療方法的研究工具。

市面上量測細胞存活率的方法與工具有哪些？

以操作方式做區分，可分為手動(人工)與自動計數。

手動方式需以人工完成染色、試劑添加等步驟後，在合適設備輔助下分析或計算數量，再依分析/計數結果換算出細胞懸浮液濃度並求出存活與死亡細胞數的比例。

自動計數則是藉由機器的輔助，簡化測定過程中人力的投入，經由機器自動計算結果。

若以測定的原理來區分，則可大致分為兩類：

1. 專注死細胞方法：

台盼藍（trypan blue）是常用於區分活細胞與死細胞的生物染色劑。其染色法為染料排斥試驗（dye exclusion）藉由染劑能夠滲入死細胞，但會被活細胞的細胞膜阻隔的特性，加以區分以利進行存活率的計算。然而，即使有些細胞仍是活的但已失去功能，卻有可能不會遭到染色。以往trypan blue染色後的樣品會透過顯微鏡觀察並人工完成計數，現在亦有自動細胞計數器能夠自動辨識影像並完成分析。LDH Assay Kit則是以化學呈色的方式進行測定，細胞破損後LDH會被釋放出細胞外並將WST還原成黃色產物，因此測量呈色的變化及可換算出LDH被釋放的量，來推測細胞死亡程度。

2. 專注活細胞的方法：

以偵測細胞代謝活性，例如測量粒線體脫氫酶（Dehydrogenase）的活性，進而反應細胞的存活率。

以MTT試驗為例，MTT會被活細胞粒線體轉化成甲䐶(formazan)晶體，利用吸光度的測定去評估粒線體的活躍程度，即可推估出活細胞數量。其靈敏度高，但轉化後的甲䐶晶體不溶於水，需經溶解後才能檢測，不僅增加工作量，間接也會影響實驗的準確性。CCK-8則是檢測粒線體酵素活性，藉由染劑被酵素還原後的顏色變化以推估存活的細胞量。

上述的兩類方法，均是針對細胞本身或產物進行染色或呈色後分析換算出細胞存活的比率，雖然關注的對象及呈色方式不盡相同，但都需要在樣品中加入額外的試劑方能測量細胞活力。然而，這些試劑會造成細胞毒性，且隨著呈色時間增加，會造成樣品中死細胞的數目持續增加，可能進而導致測量的誤差。

可以在不使用額外試劑的情況下測量細胞存活率嗎？

在傳統顯微鏡下計數細胞或使用坊間自動細胞計數器，需依靠樣品吸收光後所呈現的畫面影像供測量進行。由於大部分的生物樣品在人眼辨識下難以呈現出明顯的顏色對比，往往需要藉由染色或呈色的方式來協助估算細胞存活率。

許多生物或醫學研究領域中（如藥物開發）需要重複測定細胞活性。然而，長時間暴露在試劑下，可能造成細胞毒性，從而影響了細胞存活率的測量準確度。

在細胞死亡過程中會伴隨細胞型態發生劇烈變化，例如體積變化或細胞破碎；相較於一般光學攝影，全像顯微攝影技術可以捕捉細胞死亡過程中的型態及結構變化。活細胞外觀特徵有完整的細胞膜深色輪廓。相反地，最初死細胞的表現為黑色物體，隨著時間到晚期時，由於細胞膜破裂和細胞質滲漏等過程，因而造成細胞的邊界模糊不清。

3D全像顯微攝影(Digital holographic microscopy, DHM)技術可在免使用染色劑（呈色劑）輔助的情況下收集細胞型態的完整資訊，並由電腦自動完成辨別與計算。透過光源束穿過樣品，因不同物體的折射率不同，有些光線會產生繞射（若碰到樣品），其餘光線則會直接穿透（無碰到樣品）。最後機台內的相機感測器會收集所有繞射光線與穿透光線，經由電腦自動計算產生全像攝影影像圖。

經由收集細胞立體結構影像，與以往的平面細胞影像觀察相比，包含更多有關細胞樣品訊息，例如細胞膜的完整性和蛋白質含量的不同就會造成3D全像顯微攝影圖的差異，這也是為什麼可以取得更多細胞訊息的原因。

過去我們從顯微鏡下觀察到的細胞影像為平面影像，人眼再從平面影像進行分析作業。如今，技術不斷提升，獲取立體影像可以得到細胞更完整地資訊，再輔以電腦及AI人工智慧演算，得以讓整個分析流程更加快速且自動化。

fluidlab R-300機台使用深度神經網路(CNN)進行自動演算，準確的分析評估3D全像顯微攝影所獲取的影像資訊。當機台的相機感應器取得全像攝影影像圖後，內建電腦會根據細胞的外觀型態不同加以分辨，取得計數細胞(方框標註計數細胞)及分辨活細胞與死細胞(以綠色及橘色標註不同種類)。最後，除了能夠得到細胞數量的數據結果，報告還附加直方圖與影像圖。直方圖會記錄全尺寸範圍的細胞數量，並且可手動調整細胞尺寸範圍，以了解不同細胞大小內的活細胞與死細胞數量，也可藉此排除細胞碎片等其他干擾項。

因應學術研究與產業環境的改變

fluidlab R-300機台除了可以自動細胞計數及存活率分析，還配有免費且好用的傳輸軟體，能夠快速整理實驗數據與圖片。大量細胞計數與分析後，不必再一一整理數據結果與細胞影像，受到研究人員青睞，數篇論文以fluidlab R-300機台發表論文。

Anne Marzi與Kai Moritz Eder在研究中對聚合物奈米載體進行細胞毒性測試，當中運用到fluidlab R-300以進行細胞計數，實驗結果具有良好的精確性及再現性表現。

來自德國的研究團隊研發比色化學傳感器以偵測生物液體中的脯胺酸（Proline），當中運用到fluidlab R-300以進行定性及定量分析，較以往的方式更快且更精確。

fluidlab R-300將細胞計數與分光光度計兩項分析技術合於一機，有效提升基礎實驗效率。細胞計數器功能的部分，搭配諾貝爾物理獎技術-3D全像顯微攝影（Digital Holographic Microscopy），不再需要染色試劑，以更不僅達到綠色環保的方式分析樣品，且可以省去等待的時間。此外，在分光光度計的表現效能上可檢測波長範圍375nm到700nm的全波段光譜。高穩定、免校正的可攜式設計，亦可直接帶至細胞房或無菌操作台內。